دليل المشتري PCR تكنولوجيا
تعد تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عنصرًا أساسيًا في عدد لا يحصى من معامل البحث والاختبار ، في مجموعة من المجالات بما في ذلك الطب الحيوي والتشخيص السريري واختبار الأحياء الدقيقة للأغذية والطب الشرعي الجنائي. تستخدم هذه التقنية الأساسية التدوير الحراري لتسهيل سلسلة من التفاعلات التي يتم فيها تكرار عينة الحمض النووي بشكل سريع وأسي لإنتاج ملايين أو مليارات نسخ التسلسل. عند الحصول على نظام PCR جديد ، من المهم مراعاة الأهداف النهائية للتطبيق الخاص بك ، ودقة وكفاءة معدات التدوير الحراري وقدرة الأداة ومرونتها. تقدم هذه المقالة نظرة عامة على الخيارات والميزات المختلفة المتاحة لأنظمة PCR للمساعدة في تضييق نطاق نظام مناسب لتطبيقك.
1. PCR مقابل qPCR مقابل dPCR
بينما تقوم جميع أنظمة PCR بتكرار الحمض النووي باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل ، هناك منهجيات مختلفة مستخدمة بواسطة أنظمة مختلفة لتحقيق نتائج محددة. من بين هذه الطرق المختلفة PCR القياسي ، PCR الكمي (qPCR) و PCR الرقمي (dPCR).
تُستخدم آلات PCR القياسية عادةً لتضخيم الحمض النووي لمزيد من الاختبار والاستخدام ؛ بمعنى ما ، تُستخدم هذه التقنية كوسيلة لتوليد منتج نهائي بدلاً من كونها طريقة اختبار تحليلي بحد ذاتها. لا يمكن قياس الحمض النووي المتضخم إلا بعد تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل إذا اكتمل ، وليس في الوقت الفعلي ، وبالتالي يُشار إلى هذه الطريقة أحيانًا باسم نقطة نهاية تفاعل البوليميراز المتسلسل. يتم استخدام المنتج النهائي لتضخيم PCR التقليدي بشكل شائع للاستنساخ والتسلسل في المصب ، ويمكن أيضًا التحقق منه باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام لتأكيد وجود التسلسلات المستهدفة وكميتها النسبية بدقة منخفضة (بناءً على كثافة النطاق).
لمزيد من التحديد الكمي السريع والدقيق لمقدار التسلسل المستهدف الموجود في العينة ، يستخدم PCR الكمي (qPCR) ، المعروف أيضًا باسم PCR في الوقت الحقيقي ، مجسات الفلورسنت أثناء عملية التضخيم لمراقبة كمية الحمض النووي الموجودة بعد كل دورة حرارية. من خلال مراقبة عدد الدورات اللازمة لتلبية حد معين من شدة التألق ، يمكن للمحلل تحديد كمية الحمض النووي في مادة البداية عند مقارنة النتائج بمنحنى قياسي. يمكن لـ qPCR أيضًا تأكيد وجود أو عدم وجود تسلسل مستهدف بسرعة أكبر من نقطة النهاية PCR ، وبالتالي يتم استخدامه في تطبيقات التشخيص مثل اكتشاف السارس-CoV-2 (باستخدام النسخ العكسي لتحويل الحمض النووي الريبي الفيروسي أولاً إلى كدنا).
PCR الرقمي (dPCR) هو طريقة كمية أخرى تحدث فيها تفاعلات PCR في آلاف غرف التفاعل المنفصلة ، ويمكن تحديد العدد المطلق لجزيئات الحمض النووي في العينة الأصلية بناءً على عدد غرف التفاعل التي تنتج إشارة الفلورسنت بعد اكتمال التضخيم . على عكس qPCR ، لا يتم إجراء قياسات الفلورسنت في الوقت الفعلي وليس هناك حاجة إلى منحنى قياسي لتحديد الحمض النووي في العينة. في حين أن dPCR يأتي عادةً بإنتاجية محدودة وتكاليف أعلى من qPCR ، إلا أنه أكثر دقة وحساسية ودقة في تحديد كمية الحمض النووي وهو مفيد بشكل خاص في تطبيقات مثل اكتشاف الطفرات النادرة وتعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (النيوكلوتايد).
يعد تحديد ما إذا كنت ستختار نقطة النهاية (النوعية / شبه الكمية) PCR مقابل الطريقة الكمية (qPCR أو dPCR) أمرًا بسيطًا نسبيًا عندما تفكر في طلبك ، ولكن قد يكون الاختيار بين qPCR و dPCR أكثر دقة. يعد qPCR إنتاجية عالية وفعالية من حيث التكلفة وحساسة بدرجة كافية للعديد من التطبيقات ، ولكن قد يكون dPCR خيارًا أفضل إذا كان القياس الكمي المطلق مع حدود الكشف المنخفضة أمرًا بالغ الأهمية ..
2. أهمية التحكم في درجة الحرارة
إن قدرة أجهزة التدوير الحرارية على ضبط درجة حرارة العينات والتحكم فيها بدقة وكفاءة هي ما يمكّن من نجاح تفاعلات التضخيم ويجب أن تكون محورًا رئيسيًا لاختيار أي نظام PCR. قد تقدم الأنظمة المختلفة إمكانات مختلفة فيما يتعلق بمعدلات المنحدرات وتوحيد درجة الحرارة والدقة والقدرة على تحقيق تدرجات درجة الحرارة عبر الكتل الحرارية للمساعدة في تحسين طريقة PCR.
يشير معدل المنحدر إلى سرعة تغيرات درجة الحرارة بين خطوات التدوير الحراري ويتم التعبير عنه عادةً بالدرجات المئوية في الثانية (درجة مئوية / ثانية) في مواصفات الجهاز. قد يقدم المصنعون معلومات عن معدلات المنحدرات القصوى ومتوسط معدلات المنحدرات وكذلك التفريق بين معدلات المنحدر (التسخين) ومعدلات المنحدر السفلي (التبريد) للأداة. بشكل عام ، تتوافق معدلات المنحدرات المرتفعة مع أوقات التشغيل الأسرع ، ولكن يجب على المشترين توخي الحذر بشأن التركيز على معدلات المنحدرات القصوى دون فحص المقاييس الأخرى المتعلقة بسرعة الأداة. قد تحقق الأداة أعلى معدل منحدر فقط لفترة قصيرة من الوقت ، وسيعكس متوسط معدل المنحدر بشكل أفضل وتيرة التغيرات في درجات الحرارة. في حين أن مواصفات معدل المنحدر قد تعطي فكرة عامة عن مدى السرعة التي يمكن أن تعمل بها أدوات معينة ، عندما يكون ذلك ممكنًا ،
تعد دقة درجة الحرارة والتوحيد أيضًا مفتاحًا للتفاعلات الناجحة ، وبينما تم تصميم جميع أجهزة التدوير الحرارية لإنتاج درجات الحرارة اللازمة لـ PCR ، يمكن أن توفر بعض الميزات درجة أعلى من الثقة ، وهو أمر بالغ الأهمية للتطبيقات التي قد تكون فيها العينات محدودة وتكون النتائج الموثوقة أهمية قصوى كما هو الحال في التشخيص السريري والطب الشرعي. يعد التحكم الدقيق في درجة الحرارة أمرًا ضروريًا أيضًا عند استخدام آلة PCR للتقنيات الحساسة مثل تحليل الذوبان عالي الدقة (إدارة الموارد البشرية). يمكن أن يضمن الغطاء المسخن تجانسًا أفضل لدرجة الحرارة في جميع أنحاء أنبوب PCR ، لأنه بدون غطاء مسخن ، يمكن أن تتبخر العينة وتتكثف إلى الجزء العلوي من الأنبوب حيث تكون درجة الحرارة أكثر برودة. يؤثر تصميم الكتلة الحرارية أيضًا على التحكم في درجة الحرارة ؛ كتل الألمنيوم هي الخيار الأكثر اقتصادا ولكنها أقل موصلة ، مما يعني أنها ستحقق انتظام درجة الحرارة بشكل أبطأ وستكون معدلات انحدارها أقل من الكتل الموصلة. تعتبر الكتل المطلية بالفضة والذهب أغلى ثمناً ولكنها تسمح بنقل الحرارة بسرعة أكبر ، مما يضمن توزيعًا متساويًا لدرجة الحرارة عبر الكتلة.
يمكن أن تتطلب أهداف الحمض النووي المختلفة درجات حرارة مختلفة لتحقيق أفضل نتائج تضخيم ؛ على سبيل المثال ، تحتاج التسلسلات الغنية بالـ GC إلى درجات حرارة أعلى للتمسخ. تتأثر درجات حرارة التلدين المثالية أيضًا بمجموعة من العوامل - في حين أن درجات الحرارة لهذه الخطوة عادةً ما يتم اختيارها بناءً على درجات حرارة انصهار البادئات ، والاختلافات في درجات حرارة الانصهار بين أزواج التمهيدي ، وتأثير تركيز الكاشف ، ودرجة الحموضة ، وتركيز الملح يمكن جميعها جعل تحسين ظروف درجة حرارة التفاعل مهمة معقدة. تم تصميم آلات PCR ذات القدرات المتدرجة لدرجة الحرارة للمساعدة في تحسين طرق PCR من خلال السماح باختبار درجات حرارة التلدين المتعددة في جولة واحدة. اعتمادًا على أنواع وتنوع العينات التي تخطط لتحليلها باستخدام جهاز PCR الخاص بك ،
3. الكتل الحرارية
كما ذكرنا ، فإن الكتلة الحرارية المستخدمة مع أداة PCR يمكن أن تحدث فرقًا في التحكم في درجة الحرارة ، لكن تصميم الكتلة - وتصميم الجهاز لاستيعاب الكتل المختلفة - يؤثر أيضًا على الإنتاجية والتكاليف الاستهلاكية والمرونة. ستتوفر الكتل النموذجية بتنسيق 96-نحن سوف أو 384-نحن سوف ، على الرغم من توفر تنسيقات أخرى مثل 48-نحن سوف و 1536-نحن سوف. يتيح عدد الآبار الأعلى إنتاجية أعلى مع أحجام تفاعل أقل ، والتي ستكون في البداية أكثر تكلفة ولكنها في النهاية تخفض السعر لكل تفاعل بسبب انخفاض حجم الكاشف المستخدم لكل بئر. بالنظر إلى عدد العينات التي ستعالجها وعدد المرات التي ستستخدم فيها الماكينة ، ستأخذ في الحسبان ما إذا كانت الكتلة الحرارية ذات العدد المنخفض أو الأعلى من البئر ستكون أكثر عملية وفعالية من حيث التكلفة لمختبرك.
تأتي بعض الأدوات بتنسيق كتلة ثابت بينما يسمح البعض الآخر باستخدام الكتل القابلة للتبديل ، مما يوفر مزيدًا من المرونة للتبديل بين تنسيقات 96 و 384 جيدًا أو بين مواد كتلة مختلفة لتطبيقات مختلفة. تستوعب بعض أجهزة التدوير الحرارية أيضًا العديد من الكتل في نفس الجهاز ، مما يتيح تشغيل بروتوكولات مختلفة على مجموعات مختلفة من العينات في نفس الوقت .3 تعمل الكتل ذات الأبعاد "العالمية" على زيادة المرونة في استخدام أنابيب أو شرائط أو ألواح PCR مختلفة الحجم حسب الحاجة .
نظرًا للدور الرئيسي لهذا المكون في التحكم في درجة الحرارة ومعالجة العينة والإنتاجية ، يجب مراعاة خيارات الكتلة الحرارية بعناية عند اختيار جهاز تدوير حراري. بالنسبة للمختبرات ذات الحجم المنخفض من العينات ، أو تلك التي تشغل بشكل روتيني عددًا قليلاً فقط من الاختبارات ، قد تكون أدوات الكتل الثابتة منخفضة التكلفة ذات التنسيق القياسي 96 جيدًا كافية. ومع ذلك ، قد تكون الأدوات المعيارية المرنة مفيدة للمختبرات التي لديها عدد أكبر من البروتوكولات ، وأحجام عينات متفاوتة والمزيد من المستخدمين الذين يعتمدون على نفس الأداة لإجراء فحوصاتهم الخاصة ، وكذلك المختبرات التي قد ترغب في توسيع قدرتها الإنتاجية في المستقبل.